خط مشی دسترسیدرباره ما
ثبت نامثبت نام
راهنماراهنما
فارسی
ورودورود
صفحه اصلیصفحه اصلی
جستجوی مدارک
تمام متن
منابع دیجیتالی
رکورد قبلیرکورد بعدی
نوع مدرک : TF
زبان مدرک : فارسی
شماره رکورد : 55068
شماره مدرک : ۳۸۹۶پ
شماره راهنما : QW
سرشناسه : زینی‏، بهروز
عنوان و نام پديدآور : [پایان نامه]طراحی روش Multiplex Real-Time PCR به منظور شناسایی ایزوله¬های جدا¬شده گونه¬های انتروكوك از نمونه¬های کلینیکی و مواد غذایی براساس روش Melting Curve Analysis/ پژوهش و نگارش:بهروز زینی ؛ استادان راهنما: رسول یوسفی مشعوف ، محمدرضا عربستانی
وضعيت : همدان: دانشگاه علوم پزشکی، دانشكده پزشكي، كارشناسي ارشد ميكروب شناسي .، ۱۳۹۵
صفحه شمار : ۱۱۷ص.: مصور، جدول، نمودار
چکيده : مقدمه: انتروكوك ها کوکسی های گرم مثبت، آئروتولرانت و کاتالاز منفی متعلق به گروه باکتری های اسید لاکتیک می باشد. روش رایج تشخیص این باکتری تست های بیوشیمیایی شامل تشخیص اولیه با انواع محیط کشت و یا استفاده از سیستم های تشخیص تجاری می باشد. چنین روش هایی از نظر زمان، پیچیدگی و از نظر تشخیص اختصاصی سویه ها دچار مشکل هستند. تشخیص بواسطه واکنش های آنالیز Melting Curve Analysis یکی از کم خطاترین روش ها در تشخیص می باشد. جهت طراحی پرایمر اختصاصی گونه با هدف قرار دادن سایت های خاصی که مسئول کد کردن ژنهای منحصر به فردی هستند ، می توان گونه های مختلف انتروكوك را مورد شناسایی قرار داد. بر این اساس هدف از این مطالعه طراحی پرایمرهای اختصاصی جهت شناسایی گونه های مختلف انتروكوك با استفاده از روش Melting Curve Analyzing مبتنی بر Real-Time PCR می باشد. مواد و روش ها: با استفاده از نمونه های موجود در بانک باکتریایی آزمایشگاه میکروب شناسی دانشگاه علوم پزشکی همدان، مراحل آزمایش طراحی شد. همه این نمونه ها در ابتدا توسط آزمون PCR مورد تایید قرار گرفتند. طراحی پرایمرها براساس سایت های هدف انتخاب شده برای ژن های گونه های مختلف انتروكوك از جمله ژن divIVA در انتروكوك فکالیس ، ژن Alanine racemase درانتروكوك فاسیوم ،ژن VanCدر انتروكوك گالیناروم و در گونه های انتروكوك کاسلی فلاووس وانتروكوك آویوم ژن های EF-tu و S 16صورت گرفت. طراحی پرایمرهای با استفاده از نرم افزارهایMega4، Allele ID6، Oligo 6 و Oligo analyzer انجام گرفت. برای انجام آزمون حساسیت پرایمرهای طراحی شده با استفاده از تهیه استاندارد باکتریایی با غلظت نیم مک فارلند (CFU/ml 1.5 × 108)، اقدام به تهیه رقت سریال از 107 تا 101 باکتری شد و بصورت سه تایی (Triplicate) در سه روز متوالی برای رقت های تهیه شده آزمون Real-Time PCR انجام پذیرفت. همچنین به منظور انجام آزمون اختصاصیت پرایمرهای تهیه شده از سویه های کنترل مثبت باکتری های انتروكوك استاندارد Enterococcus facials ATCC 29212 و ایزوله شده از مواد غذایی ، لبنی و نمونه های کلینیکی مانندانتروكوك فکالیس، انتروكوك آویوم، انتروكوك فاسیوم، انتروكوك گالیناروم و همچنین از DNA سایر باکتریها از جمله (Acinetobacter baumannii ATCC 19606 ، Escherichia coli ATCC 25922، Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 ، وStaphylococcus aureus ATCC 29213) به عنوان کنترل منفی استفاده شد و در نهایت جداسازی گونه های مختلف انتروكوك از یکدیگر با استفاده از آنالیز Melting urve انجام شد. یافته ها: همه نمونه هایی که در ابتدا با آزمون PCR و تعیین توالی نوکلئوتیدی از نظر جنس و گونه تایید شده بودند بعد از انجام آزمون Melting Curve Annalysis بر روی نمونه ها و تفسیر نمودارهای بدست آمده، با نتایج اولیه کاملا مطابقت داشتند. براساس Melting Curveهای بدست آمده، دمای بدست آمده از نتیجه بلست پرایمرها در پایگاه داده NCBI با دمای بدست آمده از دمای ذوب DNA در واکنش Real-Time یکسان بودند. بطوری که منحنی حاصل از تکثیر ژن divIVA در انتروكوك فکالیس در همه رقت ها دمای 6/76 درجه سانتیگراد، و منحنی های حاصل از تکثیر ژن Alanine racemase در انتروكوك فاسیوم دمای93/80 درجه سانتیگراد ، منحنی های حاصل از تکثیر ژن EF-tu در انتروكوك کاسلی فلاووس دمای9/82 درجه سانتیگراد، منحنی های حاصل از تکثیر ژن vanC در انتروكوك گالیناروم دمای1/79 درجه سانتیگراد و منحنی های حاصل از تکثیر ژن 16S در انتروكوك آویوم دمای1/85 درجه سانتیگراد را نشان داد. با بدست آوردن غلظت در رقت های 101 تا 107 مشخص شد که پرایمر طراحی شده برای انتروكوك فاسیوم و انتروكوك فکالیس قدرت شناسایی 15CFU باکتری ، پرایمر طراحی شده برای انتروكوك آویوم قدرت شناسایی 20باکتری، پرایمر طراحی شده برایانتروكوك گالیناروم قدرت شناسایی 10 باکتری و پرایمرهای طراحی شده برای انتروكوك کاسلی فلاووس قدرت شناسایی 25باکتری را دارا می باشد. با استفاده از پرایمرهای اختصاصی به همراه DNA های گونه های متفاوت، اختصاصیت پرایمر های طراحی شده تعیین شد.جهت بررسی کیفیت قطعات ژنومی تکثیر شده در واکنشReal-Time PCR ،محصولات واکنش در ژل الکتروفورز5/1 درصد بارگذاری شدند. از مارکر مولکولی با اندازه 100 جفت بازی در واکنش فوق، استفاده شد و باندهایی به طول 123 جفت مربوط به تکثیر موفیت آمیز ژن divIVA انتروكوك فکالیس ، طول 248 جفت باز مربوط به تکثیر موفقیت آمیز ژن Alanine racemase انتروكوك فاسیوم، طول 158 جفت باز مربوط به تکثیر موفقیت آمیز ژن ژن VanC انتروكوك گالیناروم، طول 171 جفت باز مربوط به تکثیر موفقیت آمیز ژن EF-tu انتروكوك کاسلی فلاووس و طول 138 جفت باز مربوط به تکثیر ژن 16S انتروكوك آویوم به دست آمد. نتایج حاصل از بلست محصولات ژن divIVA در باکتری Enterococcus faecalis ، تکثیر ژن Alanine racemase در باکتری Enterococcus faecium ، ژن vanC در انتروكوك گالیناروم، ژن 16S در انتروكوك آویوم و ژن EF-tu در انتروكوك کاسلی فلاووس نشان دهنده عدم همولوژی پرایمرهای طراحی شده با باکتری های دیگر بود. همچنین نتایج Alligment نشان دهنده حساسیت و اختصاصیت بسیار مناسب برای شناسایی باکتری های مورد مطالعه بودند. نتیجه گیری: با توجه به Cycle Threshold های بدست آمده از آزمون Melting Curve Annalysis می توان به این نتیجه رسید که این آزمون یکی از حساس ترین آزمون های طراحی شده برای تعیین جنس و گونه های مختلف در انتروكوك ها می باشد که می تواند علاوه بر صرفه جویی بسیار مناسب در وقت، دقت . کارایی گزارشات مثبت را بالا برد و از بروز گزارشات منفی کاذب و مثبت کاذب در تشخیصات آزمایشگاهی جلوگیری کرد.
موضوع : ‏‏ انتروكوك
Enterococcus
واكنش زنجيره آني پلي مراز
Real-Time Polymerase Chain Reaction
آناليز حرارتي
Thrmal Analysis
شناسه افزوده : ‏ یوسفی مشعوف ‏، رسول ، استاد راهنما
عربستانی‏، محمدرضا ، استاد راهنما
 
 
 
(در صورت عدم وضوح تصویر اینجا را کلیک نمایید)