خط مشی دسترسیدرباره ما
ثبت نامثبت نام
راهنماراهنما
فارسی
ورودورود
صفحه اصلیصفحه اصلی
جستجوی مدارک
تمام متن
منابع دیجیتالی
رکورد قبلیرکورد بعدی
نوع مدرک : TF
زبان مدرک : فارسی
شماره رکورد : 56382
شماره مدرک : ۴۰۴۵پ
شماره راهنما : QW
سرشناسه : ‏حیدری، نرگس ‏
عنوان و نام پديدآور : [پایان نامه]طراحی روش Multiplex Real-time PCR به منظور تشخیص و شناسایی استافیلوکوک اورئوس از استافیلوکوک های کوآگولاز منفی بر اساس روشMelting Curve Analysis بر روی ایزوله های جداشده از نمونه های بالینی/ پژوهش و نگارش:نرگس حیدری ؛ استاد راهنما: محمدرضا عربستانی ؛ استادان مشاور: محمد یوسف علیخانی، فرید عزیزی جلیلیان
وضعيت : همدان: دانشگاه علوم پزشکی، دانشکده پزشكي، كارشناسي ارشد در رشته ميكروب شناسي.، ۱۳۹۶
صفحه شمار : ۱۰۸ص.: جدول، نمودار، مصور(رنگي)
چکيده : مقدمه: استافیلوکوک ها کوکسی های گرم مثبت، باکتری های کروی شکلی هستند که حدود یک میکرون قطر دارند و به صورت خوشه های نامنظمی قرار می گیرند. این باکتری بدون حرکت است و اسپور تولید نمی کند. روش رایج تشخیص این باکتری تست های بیوشیمیایی شامل تشخیص اولیه با انواع محیط کشت و یا استفاده از سیستم های تشخیص تجاری می باشد. چنین روش هایی از نظر زمان، پیچیدگی و از نظر تشخیص اختصاصی سویه ها دچار مشکل هستند. تشخیص بواسطه واکنش های آنالیز Melting Curve Analysis یکی از کم خطاترین روش ها در تشخیص می باشد. جهت طراحی پرایمر اختصاصی گونه با هدف قرار دادن سایت های خاصی که مسئول کد کردن ژنهای منحصر به فردی هستند، می توان گونه های مختلف استافیلوکوک را مورد شناسایی قرار داد. بر این اساس هدف از این مطالعه طراحی پرایمرهای اختصاصی جهت شناسایی گونه های مختلف استافیلوکوک با استفاده از روشMelting Curve Analysis مبتنی بر Real-time PCR می باشد. مواد و روش ها: با استفاده از نمونه های موجود در بانک باکتریایی آزمایشگاه میکروب شناسی دانشگاه علوم پزشکی همدان، مراحل آزمایش طراحی شد. همه این نمونه ها در ابتدا توسط آزمون PCR مورد تأیید قرار گرفتند. طراحی پرایمرها بر اساس سایت های هدف انتخاب شده برای ژن های گونه های مختلف استافیلوکوک از جمله ژن its در استافیلوکوک اورئوس، ژن sap در استافیلوکوک ساپروفیتیکوس، ژن mvaA در استافیلوکوک همولیتیکوس، ژن phop در استافیلوکوک اپیدرمیدیس، ژن مقاومتی mecA و ژن mupA در استافیلوکوک اورئوس و ژن 16srRNA صورت گرفت. طراحی پرایمرها با استفاده از نرم افزارهای Mega4، Allele ID6، Oligo6 و Oligo analyzer انجام گرفت. برای انجام آزمون حساسیت پرایمرهای طراحی شده با استفاده از تهیه استاندارد باکتریایی با غلظت نیم مک فارلند (CFU/ml 108×5/1)، اقدام به تهیه رقت سریال از 108 تا 101 باکتری و بصورت سه تایی (Triplicate) در سه روز متوالی برای رقت های تهیه شده آزمون Real-time PCR انجام پذیرفت. همچنین به منظور انجام آزمون اختصاصیت پرایمرهای تهیه شده از سویه های کنترل مثبت باکتری های استافیلوکوک استانداردStaphylococcus aureus ATCC 29213 و همچنین ازDNA سایر باکتریها از جمله (Acinetobacter baumannii ATCC 19606 ،Escherichia coli ATCC 25922، Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 وStaphylococcus aureus ATCC 29213) به عنوان کنترل منفی استفاده شد و در نهایت جداسازی گونه های مختلف استافیلوکوک از یکدیگر با استفاده از آنالیز Melting curve انجام شد. یافته ها: همه نمونه هایی که در ابتدا با آزمون PCR و تعیین توالی نوکلئوتیدی از نظر جنس و گونه تأیید شده بودند بعد از انجام آزمون Melting Curve Annalysis بر روی نمونه ها و تفسیر نمودارهای بدست آمده، با نتایج اولیه کاملاً مطابقت داشتند. بر اساس Melting Curveهای بدست آمده، دمای بدست آمده از نتیجه BLAST پرایمرها در پایگاه داده NCBI با دمای بدست آمده از دمای ذوب DNA در واکنشReal-time PCR یکسان بودند. بطوریکه منحنی حاصل از تکثیر ژن its در استافیلوکوک اورئوس در همه رقت ها دمای 73/83 درجه سانتیگراد، منحنی های حاصل از تکثیر ژن sap در استافیلوکوک ساپروفیتیکوس دمای 49/76 درجه سانتیگراد، منحنی های حاصل از تکثیر ژن mvaA در استافیلوکوک همولیتیکوس دمای 2/78 درجه سانتیگراد، منحنی های حاصل از تکثیر ژن phop در استافیلوکوک اپیدرمیدیس دمای 2/74 درجه سانتیگراد، منحنی های حاصل از تکثیر ژن مقاومتی mecA دمای 6/76 درجه سانتیگراد، منحنی های حاصل از تکثیر ژن mupA دمای 83/74 درجه سانتیگراد و منحنی های حاصل از تکثیر ژن 16srRNA دمای 57/79 درجه سانتیگراد را نشان داد. با بدست آوردن غلظت در رقت های 101 تا 108 مشخص شد که پرایمرهای طراحی شده برای ژن های its,phop ,sap و 16srRNA توانایی شناسایی کمتر از CFU 150 باکتری، برای ژن mvaA قدرت شناسایی CFU 15 باکتری، برای ژن مقاومتی mecA و mupA قدرت شناسایی کمتر از CFU1500 باکتری را دارا می باشد. با استفاده از پرایمرهای اختصاصی به همراه DNA های گونه های متفاوت، اختصاصیت پرایمرهای طراحی شده تعیین شد. جهت بررسی کیفیت قطعات ژنومی تکثیر شده در واکنش Real-time PCR، محصولات واکنش در ژل الکتروفورز 5/1درصد بارگذاری شدند. از مارکر مولکولی با اندازه 100 جفت بازی در واکنش فوق، استفاده شد و باندهایی به طول 155 جفت مربوط به تکثیر موفیت آمیز ژن its استافیلوکوک اورئوس، طول 297 جفت باز مربوط به تکثیر موفقیت آمیز ژن mecA، طول 271 جفت باز مربوط به تکثیر موفقیت آمیز ژن mvaA استافیلوکوک همولیتیکوس، طول 136 جفت باز مربوط به تکثیر موفقیت آمیز ژن sap استافیلوکوک ساپروفیتیکوس، طول 98 جفت باز مربوط به تکثیر ژن phop استافیلوکوک اپیدرمیدیس، طول 76 جفت باز مربوط به تکثیر ژن mupA و طول 190 جفت باز مربوط به تکثیر ژن 16srRNA بدست آمد. نتایج حاصل از BLAST محصولات ژن its،mecA ،mupA در باکتری استافیلوکوک اورئوس، تکثیر ژن mvaA در باکتری استافیلوکوک همولیتیکوس، تکثیر ژن sap در باکتری استافیلوکوک ساپروفیتیکوس، تکثیر ژن phop در باکتری استافیلوکوک اپیدرمیدیس و تکثیر ژن 16srRNA نشان دهنده عدم همولوژی پرایمرهای طراحی شده با باکتری های دیگر بود. همچنین نتایج تطبیق گذاری نشان دهنده حساسیت و اختصاصیت بسیار مناسب برای شناسایی باکتری های مورد مطالعه بودند. نتیجه گیری: با توجه به CT های بدست آمده از آزمون Melting Curve Annalysis می توان به این نتیجه رسید که این آزمون یکی از حساسترین آزمون های طراحی شده برای تعیین جنس و گونه های مختلف در استافیلوکوک ها می باشد که می تواند علاوه بر صرفه جویی بسیار مناسب در وقت، دقت و کارایی گزارشات مثبت را بالا برد و از بروز گزارشات منفی کاذب و مثبت کاذب در تشخیصات آزمایشگاهی جلوگیری کرد.
موضوع : ‏‏استافيلوكوك
Staphylococcus
‏مقاومت داروئي
Drug Resistance
‏موپيررسين
Mupirocin
شناسه افزوده : ‏عربستانی ،محمدرضا‏ ، استاد راهنما
علیخانی،محمد یوسف ‏ ، استاد مشاور
عزیزی جلیلیان،فرید‏ ، استاد مشاور
 
 
 
(در صورت عدم وضوح تصویر اینجا را کلیک نمایید)